Просмотр полной версии : ИФА, проблемы при определении IgM

Уважаемые коллеги - врачи лабораторной диагностики.
Очень часто приходится сталкиваться с ложно-положительными результатами определения иммуноглобулинов М при различных инфекциях, прежде всего при обследовании на TORCH. Часто лаборатории дают какие-то полуколичественные ответы. Этог все очень мешает нам работать и портит жизнь нашим пациенткам, особенно когда речь может идти о прерывании желанной беременности при краснухе.

Расскажите, пожалуйста, что может давать такие артефакты и в чем проблема определения именно IgM?

Например, взгляните на эту тему: [Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]

Может быть успокоите женщину.

В данном случае я думаю, учитывая большой индекс авидности, речь идет в худшем случае о подостром токсоплазмозе и никаких движений типа амниоцентеза не нужно. Только у 10% женщин с IgM + при беременности имеется острый токсоплазмоз.
По поводу ложноположительного ИФА - это проблема, судя по всему не сильно зависящая от производителя тест-систем, по крайней мере по ЦМВ до 20% дают по зарубежным источникам ложноположит. результаты.
Недавно в Америке была статья о низкой надежности тестов на анти-HAV-IgM.
Так что проблема есть. Одним из часто называемых причин- наличие ревматоидного фактора.
Что касается дюфастона , это интересно. Попробую выяснить.

Спасибо за ответ. Попробуйте выяснить за дюфастон, хотя, ИМХО, это выдумка зав. лабораторией.

Насчет амниоцентеза - он важен для определения длительности и дозировки химиотерапии после положит. ПЦР в сыворотке крови у женщины. Я привел последние американские рекомендации пациентке.

И еще вопрос - играет ли уровень авидности антител какую-либо роль во врачебной тактике? Нигде в рекомендациях уровень авидности не упоминается...

Спасибо за ответ. Попробуйте выяснить за дюфастон, хотя, ИМХО, это выдумка зав. лабораторией.

Насчет амниоцентеза - он важен для определения длительности и дозировки химиотерапии после положит. ПЦР в сыворотке крови у женщины. Я привел последние американские рекомендации пациентке.

И еще вопрос - играет ли уровень авидности антител какую-либо роль во врачебной тактике? Нигде в рекомендациях уровень авидности не упоминается...
Собственно тест на авидность и был предложен для отбора пациентов на амниоцентез как раз в связи с проблемами при определении IgM. Читал давно уже в бюллетене БиоМерье что помогает избежать до 90% неужных амниоцентезов при токсоплазмозе. Сейчас тесты на авидность активно внедряются, учитывая и появления современных автоматов, и интерес к этому производителей росийских тест-систем. ИМХО, в смысле серологического скрининга это самы йполезный тест. В свое время (2002) мы делали авидность (не на токсоплазмоз) первыми русскими тест системами, но очень неудобные были тесты. Теперь появилось много новых тест-ситем, думаю вернуть.
Ссылки по авидности поищу.

Насчет ПЦР в сыворотке это тоже американские рекомендации? Можно ссылку?
Применение ПЦР при токсоплазмозе достаточно неоднозначная вещь. Собственно в зарубежных рекомендациях я видел только ПЦР в амниотической жидкости.

Real-Time PCR for Quantitative Detection of Toxoplasma gondii

[Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]

Это статья о ПЦР у ВИЧ-инфицированных, т.к. у них проблемы с выработкой IgM.

Американские рекомендации сейчас поищу (у меня есть в КПК в книге)

У ВИЧ-инфицированных совсем другая ситуация. Во первых, собственно у иммунокмпрометированных лиц токсоплазмоз и представляет собой проблему, а в условиях несовершенного серологического ответа ПЦР и нужна, у них есть генерализованные формы инфекции. У иммунокомпетентных лиц обнаружение в крови токсоплазм достаточно редкое явление. И не только в крови. Например, при глазном токсоплазмозе чувствительность ПЦР во внутриглазной жидкости порядка 30%... Кроме того , обнаружение токсоплазм не эквивалентно первичности инфекции, а ведь это ведущий фактор в ведении беременной.
ПЦР в амниотической жидкости доказывает инфицирование плода, поэтому и нужна.

Да, полностью согласен с Вами. Просто перед ответом пациентке решил просмотреть последние рекомендации и там как раз говорилось о том, что выявление возбудителя в сыворотке методом ПЦР более специфично по сравнению с ИФА на антитела М, то есть отметает ложно-положительные результаты. Но вот ссылочку никак не найду...

...выявление возбудителя в сыворотке методом ПЦР более специфично по сравнению с ИФА на антитела М, то есть отметает ложно-положительные результаты. А в каком проценте случаев острого токсоплазмоза положительна ПЦР в сыворотке? Ведь возможна и такая ситуация - при положительной ПЦР она подтверждает IgM, а при отрицательной исключить о. токсоплазмоз все равно нельзя... Исследование в динамике и пр.

The presence of a high Toxoplasma-specific IgM antibody titer combined with a high IgG titer probably indicates an acute infection within the previous 3 months. A low-to-medium IgM titer and a high IgG titer might indicate an acute infection 3-6 months previously, but IgM antibodies have been detected as long as 18 months after initial infection (17).

Some commercial IgM tests have had problems with specificity, resulting in unacceptably high rates of false-positive test results. In 1996, FDA and CDC conducted extensive evaluations of the six most commonly used commercial IgM kits in the United States to determine the extent of the problem with the specificity of these kits. Sensitivity and specificity rates for these six kits ranged from 93.3% to 100.0% and from 77.5% to 99.1%, respectively (18).

In addition, IgM-positive results should be confirmed by a Toxoplasma reference laboratory (18).

Treatment of acute infection during pregnancy has been associated with an approximately 50% reduction in fetal infection (22).

Небольшие цитаты отсюда ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи])

По ПЦР продолжаю смотреть в сети.

Там немного ниже об отношении к амниоцентезу в разных странах. Большинство при позит. АТ класса М все же выполняют его с целью выбора комбинации антипротозойных препаратов.

А вот выдержки из нашего любимого приказа №641-84

3.3.8. Імунологічні та молекулярно-генетичні методи діагностики: встановлюють наявність TORCH-інфекцій вагітних, які спричинюють порушення внутрішньоутробного розвитку плода. Наявність у вагітних IgG антитіл при відсутності IgM антитіл, вказують на те, що вагітна перенесла інфекцію до вагітності. Високі титри IgG антитіл при наявності ІgM антитіл вказують на наявність інфекції. Позитивний результат обстеження методом полімеразної ланцюгової реакції свідчить про наявність ДНК збудника TORCH-інфекції.

Инересная статья по методам при токсоплазмозе.
[Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]
"So-called natural or clinically non-relevant (CNR) IgM antibodies to T. gondii remain a problem for potential false-positive EIAs and immunoblots, but quantitative differences in reaction intensity are often useful for distinguishing CNR from specific IgM antibodies induced by T. gondii infection"

Здесь ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]) есть только многообещающий абстракт, но нет доступа к полному тексту. Есть эл. адрес автора - можно попросить репринты.

"Позитивний результат обстеження методом полімеразної ланцюгової реакції свідчить про наявність ДНК збудника TORCH-інфекції" - какая мысль!!! :-)

А отрицательный? Наши приказы достойны отдельного обсуждения.

Еще статья:
[Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи] ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи])



It may be assumed that most positive Toxoplasma IgM antibody test results in a setting with a low prevalence of acute seroconversion are false positives .

А у нас где-нибудь делают immunoglobulin M immunosorbent agglutination assay (ISAGA)?

Простите - быстро читал. Там говорится, что наоборот, нужен месяц, чтобы они начали выявляться...

А у нас где-нибудь делают immunoglobulin M immunosorbent agglutination assay (ISAGA)?
Уверен, что нигде.

Здесь ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]) неплохие результаты по ПЦР сэмплов амниотической жидкости.

Интересная статья с классификацией беременных при токсоплазмозе:

[Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]='antiToxoIgG%20avidity ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]='antiToxoIgG%20avidity)'



Mothers were classified according to the

classification system in immunocompetent pregnant

women as produced by the working party of

the European Research Network on Congenital

Toxoplasmosis [9].Thus categories of primary maternal

infection during pregnancy were:

• Definite: if evidence of seroconversion in pregnancy

or positive culture from maternal blood.

• Probable: if evidence of seroconversion within

two months before conception or significant

rise of IgG titers or high IgG titers, presence of

IgM and/or IgA and onset of lymphadenopathy

during pregnancy or high IgG titers and presence

of IgM and/or IgA in the second half of

pregnancy.

• Possible: if stable high IgG, without IgM, in the

second half of pregnancy or high IgG and presence

of IgM and /or IgA in the first half of pregnancy.

• Unlikely: if stable low IgG, with or without IgM

or stable high IgG, without IgM in early pregnancy.

• Not infected: if seronegative or maternal preconception

seropositive sample or positive IgM

and/or IgA without appearance of IgG.





The cut-off limits for IgG avidity were also em-

ployed to define the risk of vertical transmission.

Women were selected for further diagnostic work

if categorized as having definite, probable or possible

acute infection according to the European

Research Network and/or if IgG avidity was found

suggestive of recent infection. Patients were counseled

for amniocentesis and the criteria for amniotic

fluid sampling were as follows: first or early

second trimester as likely timing of seroconversion

and informed consent of the patient. Third

trimester referrals were advised to undergo combination

therapy without any sampling.Detection

of toxoplasma in amniotic fluid (AF) was carried

out with the use of in vitro culture and a PCR approach.

Am J Trop Med Hyg. 2004 Dec;71(6):831-5. Related Articles, Links
Detection of Toxoplasma gondii DNA and specific antibodies in high-risk pregnant women.
Nimri L, Pelloux H, Elkhatib L.
Department of Medical Laboratory Sciences, Jordan University of Science and Technology, Irbid, Jordan. [Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]
Primary maternal infection with toxoplasmosis during pregnancy is frequently associated with transplacental transmission to the fetus. This study was conducted to test the utility of a polymerase chain reaction (PCR) assay to detect recent infections with Toxoplasma in pregnant women. One hundred forty-eight women with high-risk pregnancies who had abnormal pregnancy outcomes (cases) and 100 with normal pregnancies (controls) were tested for the presence of Toxoplasma DNA in their blood by a nested PCR and specific antibodies to Toxoplasma by an enzyme-linked immunosorbent assay. The IgG results of the cases differed significantly from those of the controls (54% and 12%, respectively; P < 0.02). Four (2.7%) of the cases were IgM positive, but none of the controls were positive. Detection of Toxoplasma DNA in 20 (8.1%) of the IgG-positive cases suggests a recent infection. The risk factors associated with the infection were eating raw meat and contact with soil. The diagnostic serology of recent infection in early pregnancy could be confirmed by a positive Toxoplasma-specific PCR result in blood samples collected in the first half of pregnancy, even in the presence of serologic results difficult to interpret due to the lack of sequential follow-up during pregnancy.
PMID: 15642979 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Clin Microbiol Infect. 2004 Oct;10(10):937-9. Related Articles, Links
Rapid and sensitive diagnosis of Toxoplasma gondii infections by PCR.
Jalal S, Nord CE, Lappalainen M, Evengard B; ESCMID Study Group on Toxoplasmosis.
Karolinska Institutet, Department of Laboratory Medicine, Division of Clinical Bacteriology, Karolinska University Hospital, Huddinge, Sweden. [Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]
DNA was extracted with a modified Qiagen DNA Mini Kit method from 20 clinical samples and was amplified by PCR using specific primers for the T. gondii B1 gene. T. gondii was detected correctly in 18 of the 20 clinical samples in < 5 h, with a detection limit of two parasites/sample. The results were in good agreement with those obtained by a more complicated and time-consuming procedure involving two-step nested PCR and either liquid hybridisation or colorimetric detection using internal probes.
PMID: 15373893 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Здесь ([Ссылки могут видеть только зарегистрированные и активированные пользователи]) пишут что:

The B1 PCR performed on blood samples was less sensitive than when it was performed on other biological fluids requiring 100 tachyzoites, instead of 10.

А другие (см. выше) пишут о высокой диагностической ценности ПЦР сыворотки крови матери в случае трудноинтерпретируемых результатов ИФА.

J Egypt Soc Parasitol. 2004 Aug;34(2):559-70. Related Articles, Links

Evaluation of semi-quantitative PCR and IgG & IgM ELISA in diagnosis of toxoplasmosis in females with miscarriage.
Abdel-Hameed DM, Hassanein O.
Department of Parasitology, and Clinical Pathology, Medical Research Center, Faculty of Medicine, Ain-Shams University, Cairo 11566, Egypt.
One hundred female (age 20-42 yrs) patients were classified into group I: 40 patients presented with abortion in the first trimester; group II: 33 patients with abortion in the second trimester and group III: 27 patients with intrauterine fetal death (IUFD). The positive percentages of semi-quantitative PCR and both IgG & IgM ELISA were 38% and 35% respectively. Ten (26.3%) cases out of 38 were positive for toxoplasmosis by both PCR and ELISA-IgG, while 5 (13.2%) cases out of 38 were positive by both PCR and ELISA-IgM, whereas 16 (42.1%) cases out of 38 PCR positive cases were positive by both ELISA IgG & IgM. Sensitivity and specificity of both ELISA IgG and IgM were 81.57% & 93.54% respectively. False negative by ELISA were found in 7 cases out of 38 positive toxoplasmosis cases detected by semi-quantitative PCR. Three cases out of the 7 cases with false negative by ELISA were detected with a trophozoite copy load of 10(1) trophozoite /mL in the blood sample by semi-quantitative PCR. So, the semi-quantitative PCR detected low levels of parasite DNA recommending its usefulness especially in the early stages of the disease when low amount of antibodies can't be detected by serological method or even by the conventional PCR.
Publication Types:
Evaluation Studies

PMID: 15287178 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Здесь опять говорится о приоритете полуколичесвтенной ПЦР перед определением антител...
Конечно, нужно смотреть на дизайн исследования и полные тексты статей и многое зависит от метода ПЦР.

Вобщем я понял, что в Украине да и России ПЦР сыворотки крови пока не может быть рутинным исследованием.

В моей личной практике если пациентка обращается до беременности (а именно так я рекомендую), антитела на инфекции группы TORCH сдаются преконцепционно, что почти всегда позволяет избегать подобных казусов.

Не совсем понятно, как они доказывали recent toxoplasmosis ? Однако многообещающая статья. Похоже, прогресс идет.

В моей личной практике если пациентка обращается до беременности (а именно так я рекомендую), антитела на инфекции группы TORCH сдаются преконцепционно, что почти всегда позволяет избегать подобных казусов.
Конечно, это решает много проблем, особенно в смысле краснухи и токсоплазмоза.

Недавно у нас был скрининг всех беременных на ТОРЧ. По уму бы его результаты обработать и при последующих беременностях учитывать для адекватного назначения тестов.
Пока стараюсь это делать у нас в центре, благо есть компъютерная база обследований и можно при опросе беременной поднять ее анализы. Однако это ведь бессистемные попытки. Кто-то консультируется, кто-то нет. Опять же база только нашего центра.:(

Спасибо за ответ. Попробуйте выяснить за дюфастон, хотя, ИМХО, это выдумка зав. лабораторией.


Она не только зав.лабораторией - она врач, которая комментирует результаты и видимо назначает лечение. Сложилось впечатление, что она в этом "бизнесе" давно и набрала статистически значимые результаты. Речь шла о десятках выявленных ею совпадениях ложноположительности IGm и приема дюфастона.

Наталья.

Она не только зав.лабораторией - она врач, которая комментирует результаты и видимо назначает лечение. Сложилось впечатление, что она в этом "бизнесе" давно и набрала статистически значимые результаты. Речь шла о десятках выявленных ею совпадениях ложноположительности IGm и приема дюфастона.

Наталья.

Уважаемая Наталья,
данная тема была предназначена не для Вас, а для специалистов. Десятки, выявленные ею совпадений относятся к категории С (самой последней) по уровню доказательности. Опять же, ничего плохого не хочу сказать о зав. лабораторией, тем более заочно.